Tham dự giải năm nay có tổng cộng 14 đội, đáng chú ý, đó là sự góp mặt của PVF, đội không thể thăng hạng ở giải hạng Ba QG 2015 sau khi để thua Hà Nội T&T và An Giang ở VCK. TTK VFF Dương Nghiệp Khôi cho biết, theo điều lệ giải, do Đồng Nai bỏ cuộc nên PVF được đôn lên thay vì xếp thứ 4 chung cuộc giải hạng Ba QG 2015.
Dựa trên yếu tố khu vực, vị trí địa lý và sự thống nhất của các đội bóng, BTC đã chia làm 2 bảng đấu. Bảng A: Công an Nhân dân, Hà Nội T&T, Viettel, Bình Định, Sanatech Khánh Hòa, Lâm Đồng và Bình Thuận. Bảng B: Mancons Sài Gòn, PVF, Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Vĩnh Long và An Giang.
Theo điều lệ, các đội sẽ thi đấu vòng tròn 2 lượt đi và về ở mỗi bảng, sau đó 2 đội xếp thứ nhất ở mỗi bảng thi đấu 1 trận chung kết, đội nào thắng sẽ giành quyền lên chơi giải hạng Nhất QG 2017. Đội xếp cuối cùng sau khi xét kết quả thi đấu của 2 bảng sẽ xuống hạng.
Giải hạng Nhì QG 2016 diễn ra từ 12/4 – 12/7.